说到“克隆”这个词，很多人会想到世界上第一例运用这项技术培育出的动物——克隆羊“多莉”，它标志着生物体通过体细胞进行无性繁殖的克隆技术成为现实。随后，克隆猪、克隆牛等纷纷问世，克隆犬直至2005年才问世。犬被科学界普遍认为是最难克隆的动物之一，该领域的技术一直被韩国所垄断。

 

中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员带领希诺谷公司科研团队及广州生物院实验室团队，借助Cas9基因编辑技术，首先获得两只基因编辑犬“苹果”和“葫芦”，之后，科研人员以“苹果”体细胞作为克隆犬供体细胞，优化克隆技术平台，突破技术瓶颈，成功培育出“苹果”的克隆犬“龙龙”。这标志着我国成为继韩国之后第二个独立掌握犬体细胞克隆技术的国家。

 

2005年世界首例体细胞克隆犬“史努比”在韩国诞生，此后，犬体细胞克隆技术就一直掌握在韩国人手中，从未被其他国家突破。克隆犬是世界性难题，面临许多困难：首要问题就是如何获得足够数量成熟卵母细胞。猪、牛、羊等动物通过体外成熟培养技术可获得大量的成熟卵母细胞，而犬卵母细胞体外成熟培养效率极低，只能从体内获取成熟卵母细胞。体内成熟卵母细胞的获取，需要精确掌握犬发情排卵时间，而一旦错过一次发情排卵时间，需要等上半年或一年才有下一次机会。准确把握排卵时间十分困难，通过血清测定孕激素个体间差异大，难以确立一个统一的评判标准。冲卵时间过早，卵母细胞未成熟；时间过晚，卵母细胞已老化。如何精确掌握犬发情排卵时间，是获取高质量成熟卵母细胞的关键。

 

其次，一只犬平均排卵7-8枚，排出的卵子处于GV期，需要在输卵管内停留48-72h到达MⅡ期。犬卵母细胞中富含脂类物质，颜色较深，黏性很大，显微操作较困难，体细胞电融合效率不高。

 

最后，犬胚胎移植中受体与供体间在生殖生理阶段上难以保持一致性。妊娠率低，再加上克隆技术本身的低效率问题，使得犬体细胞克隆更是难上加难，需要投入大量的财力、人力和物力。

 

基因编辑，神奇的剪刀

 

2013年一种新的基因编辑技术（CRISPR/Cas9）风靡全球，杏耀注册它具有构建简单方便、基因打靶效率高等特点。它究竟有多神奇？它可以让基因想要就要、想没就没，随心所欲；并成功在牛、羊、猪、兔、小鼠、大鼠等动物及人类胚胎中实现基因修饰。它是否同样能在犬基因组中发挥作用呢？带着这样的好奇心，我们从2013年开始着手犬基因编辑研究。

 

实验过程并非如原先设计的一帆风顺，一年的努力并未收到预期的结果。几经周折，几次更改实验方案，神奇的剪刀终于发挥了神奇的功能，2014年6月底，世界首例基因（MSTN）敲除狗“大力神”与“天狗”诞生。四个月时，“大力神”与“天狗”就表现出超强运动能力，且“天狗”还具有明显“双肌”性状。

 

神奇的剪刀还在续写着它的神奇，2016年10月，我们着手犬APOE基因敲除，有了前期的基础研究后，实验进展非常顺利，2016年12月29日，世界首例动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”诞生。20天后，另一只APOE基因敲除犬“葫芦”诞生。故事还在不断上演，神奇的剪刀还在不断创造新的神奇。

 

从世界首例基因敲除犬到基因敲除体细胞克隆犬

 

这个奇妙的故事还得从2012年说起。当时最初的想法就是做基因敲除体细胞克隆犬， 杏耀娱乐总代团队教程，这对于我们来说几乎是零基础，唯一的资源就是韩国人发表的一些没有具体细节的文章。起初，犬的发情排卵时间鉴定都摸不着头脑，我们经过长达一年时间的不断摸索，才逐步掌握其中规律。由于前期的基础较差及实验条件的限制，先前的体细胞克隆实验并未获得成功。2013年，第三代最新基因编辑技术CRISPR/Cas9正如火如荼展开，我们首先想到将此技术运用到犬基因编辑中。经过将近一年的努力，世界首例肌肉生长抑制素基因敲除犬就这样诞生了。“大力神”和“天狗”的诞生，让团队的每个人都非常激动，大家的努力与坚持换来了最终的成功。从开始到成功，足足花了两年多的时间。这两年时间里，大家经历了一次又一次失败，而正是对失败的不断反思与改进，坚持不懈，才最终取得成功。科研的道路上，就是需要一种不服输的精神。

 

基因编辑犬做出来了，但体细胞克隆还未取得成功，赖良学研究员带领北京希诺谷研发团队及广州生物院实验室团队继续攻克这一世界性难题。提到世界首例基因敲除克隆犬“龙龙”，杏耀代理还得从它的供体“苹果”说起。“苹果”出生于2016年12月29日，是通过Cas9技术敲除APOE基因的基因编辑犬。“苹果”出生后，它的皮肤细胞就被保存下来了，之后研发人员用“苹果”的细胞进行体细胞克隆，几次实验后，2017年5月28日，世界首例基因敲除体细胞克隆犬“龙龙”诞生，之后另两只同样的克隆犬也诞生。这标志着我国成为继韩国之后第二个独立自主掌握犬体细胞克隆技术的国家，同时，首次实现犬基因敲除体细胞克隆。